By- og Landskabsstyrelsen

Bilag 4
Lægemidlers farmakologiske og toksikologiske effekter på fisk

1. Baggrund

Lægemiddelstoffer findes i miljøet i koncentrationsniveauer af størrelsesordenen ng/l til µg/l (se kapitel AA). De er ikke umiddelbart særligt akuttoksiske på fisk. Men da lægemidler er specifikt virkende stoffer, kan de potentielt udvikle en lang række kroniske effekter på bl.a. fiskearter.  Historisk set er lægemidler designet til at have en specifik effekt i et bestemt organ hos mennesker, dyr eller fugle, såvel som på deres enzymsystemer, receptorer eller anden biologisk mekanisme. Derved moduleres den fysiologiske funktion af organismen med det resultat at bedre et sygdomsforløb.

Mennesker, rotter, svin og fisk har en række hormoner, enzymsystemer, receptorer og et metabolismeapparat til fælles, der gør, at nogle lægemidler, i mere eller mindre grad, kan have en tilsvarende farmakologisk eller toksikologisk effekt på dyr og fisk, som de har det på mennesket. Da fisk og menneskers metabolismeapparat, dvs. at deres cytochrom P450 enzymer har visse ligheder (se nedenstående) såvel som uligheder, kan visse lægemidler blive metaboliseret både i fisk og i mennesket med det resultat, at de samme metabolitter dannes. Ulighederne kan også forårsage, at visse lægemidler kan hæmme fiskens cellulære metabolisme for eksempel i leveren, hvorved der kan dannes andre toksiske fase I metabolitter hos fisken end der dannes hos mennesket. Der er derfor ofte svært at forudsige om metabolismen af lægemidler i fisk og hos mennesker vil være tilsvarende. Men nogen ”read across”, som det kaldes, kan man dog gøre om disse forudsigelser. I det følgende vil der blive beskrevet sådanne eksempler.

Generelt vil lægemiddelstoffets biotilgængelighed og fisks evne til at metabolisere stoffet og den aktuelle koncentration, der findes i vandmiljøet, være faktorer, der styrer om lægemiddelstofferne vil få en farmakologisk eller specifik toksikologisk effekt på fisken.

Visse lægemidler kan udvise en mutagen eller teratogen effekt på de menneskelige gener eller afkom. Denne effekt er oftest velkendt på mennesket, men accepteret på grund af, at lægemidlet i andre henseender har unikke egenskaber. Hvis et lægemiddel har en mutagen eller teratogen effekt på mennesket, kan der som oftest være en lignende effekt hos fisk eller dets afkom, da sådanne effekter oftest skyldes stoffets toksikologiske egenskab.

Er et lægemiddelstof uden egentlig farmakologisk effekt på fisk tilstede i vandmiljøet i en tilpas høj koncentration, kan stoffet udvise det, der kaldes en narkotisk effekt (dvs. ikke-specifik effekt) hos fisken primært på grund af lægemidlers ofte unikke evne til at passere membraner.

Der er i de senere år gjort store anstrengelser for at lære fiskearternes genetik at kende. Dette er man nået længst med for zebrafisk og ørreders vedkommende. Derved er der skabt muligheder for, at forstå fisks evne til at metabolisere miljøfremmedstoffer og sammenligne denne evne med menneskets. Det har vist sig, at fisk har en næsten lige så varieret evne til at metabolisere både endogene og miljøfremmede stoffer, som mennesket har. Samtidigt er der fundet variationer i fiskearters evne til at metabolisere miljøfremmede stoffer.

Hvad angår hormonsystemer og receptorer, har fisk og mennesker også et fællesskab. Bl.a. viser dele af steroidhormongenesen, og reguleringen af gonadotropin releasing hormone (GnRH 1) hos mennesker og fisk ligheder.  Mennesker og fisk har endvidere ß1- and ß2-adrenergic receptorer til fælles, hvorved lægemiddelstoffer, såsom steoridøstrogener, hormonlignende lægemiddelstoffer, og ß-blockerne: atenolol, propranolol, metoprolol og sotalol formodentligt har en tilsvarende farmakologisk effekt på fisk (Niell et al. 2004).

2. Lægemidlers akutte toksicitet på fisk

Tabel 1 viser en oversigt over data for lægemidlers akutte toksicitet på fisk, udtrykt som EC50 (mg/l) værdier. Det vil sige, at toksiciteten er relateret til den vandige koncentration af lægemiddelstoffet i testen.  Litteraturen indeholder kun et begrænset antal data for fiskearter. Det har heller ikke været muligt at finde data for tilsvarende kroniske test på fisk for de undersøgte stoffer. Data viser dog, at lægemidler generelt har en begrænset akut toksisk effekt på fiskearter, da EC50 værdierne for de fleste stoffer findes i området fra 10 mg/l til nogle g/l. For antibiotika, der ikke har farmakologisk effekt på fisk, findes EC50 værdier på 12g/l og derover. Kun simvastatin, et lipidregulerende stof, er fundet potent hos fisk, jf. ECOSAR databasen, med en EC50 på 0,056 mg/l. De relative lave akutte toksiciteter, som ses af tabel 1, må skyldes, at fisk besidder forskellige afgiftningsmekanismer, der kan metabolisere lægemiddelstoffer og derved forhindre en narkotisk toksikologisk effekt.

Tabel 1. EC50 (mg/l) for lægemiddelstoffers akuttoksicitet på fisk.

Lægemiddelstof CAS no. Fiskeart EC50
mg/l
Reference
Acetyl-
salicylsyre
50-78-2 ECOSAR data 550-836 ECOSAR (2005)
Paracetamol 103-90-2 ECOSAR data
Zabra Fisk (Danio rerio)
Fathead minnow
1071
378
814
ECOSAR (2005)
Ferrari et al. (2004)
US EPA (2005)
Ibuprofen 15687-27-1 ECOSAR data
Blue gill (lepomis macrochirus)
Channel catfish (Ictalurus punctatus)
Coho salmon (Oncorhynchus kisutch)
Guldfisk (Carassius auratus)
Striped Bass (Morone saxatilis)
546
173
19-84
10
71-178
10-40
ECOSAR (2005)
Halling-Sørensen et al. 1998
US EPA (2005)
US EPA (2005)
US EPA (2005)
US EPA (2005)
Metformin 1115-70-4 ECOSAR data
Blue gill (Lepomis macrochirus)
33170
>982
ECOSAR (2005)
Webb (2001)
Phenoxy-
methyl
penicillin
132-98-9 ECOSAR data 814000 ECOSAR (2005)
Etodolac   No data    
Cimetidin 51481-61-9 ECOSAR data
Blue gill (Lepomis macrochirus)
572
>1000
ECOSAR (2005)
Webb (2001)
Metoprolol 56392-17-7 ECOSAR data 116 ECOSAR (2005)
Valproinsyre   No data    
Dicloxacillin   No data    
Tramadol 22204-88-2 Uspecificeret art 130 Webb (2001)
Gabapentin 60142-96-3 ECOSAR data 67672 ECOSAR (2005)
Furosemid 54-31-9 ECOSAR data 166 ECOSAR (2005)
Oxcarba-
zepin
  No data    
Dipyridamol   No data    
Sulfamethizol   No data    
Carbama-
zepin
298-46-4 ECOSAR data
Zebra fisk (Danio rerio)
14
25
ECOSAR (2005)
Ferrari et al. (2004)
Allopurinol 315-30-0 ECOSAR data 2243 ECOSAR (2005)
Amoxicillin 26787-78-0 ECOSAR data 12595 ECOSAR (2005)
Simvastatin 79902-63-9 ECOSAR data 0,056 ECOSAR (2005)

3. Metabolisme af lægemiddelstoffer

I både mennesker, dyr og fisk er cytochrome P450 enzymer ansvarlige for at metabolisere og derved for at omsætte både lægemidler, miljøfremmede stoffer og kroppens egne endogene stoffer. Cytochrom P450 består af en bred vifte af enzymsystemer kendt som CYPerne, der hver især er gode til at metabolisere visse typer stoffer eller deltage i blandt andet steroidgenesen, opbygning af fedtsyrer eller vitaminer. Hos både mennesker og fisk foregår der en stor CYP aktivitet i leveren. Indtil i dag har man hos mennesket opdaget i alt 18 typer CYPer og 43 undertype CYPer. Nogle CYPer er bedre til at metabolisere visse lægemidler end andre. De vigtigste CYPer, i lægemiddel-sammenhæng, er de oxidative CYPer, der primært findes i leveren: CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4 og CYP3A5-7. Derudover har mennesket et fase II konjugationssystem, der kan detoksificere lægemidlet ved at påsætte lægemidlet et glucoronid-, glycine-, sulfate- eller acetyl molekyle.

Andre vigtige CYPer deltager, som ovenfor forklaret, i eksempelvis i steroiddannelsen og  steroidmetabolismen. Det drejer sig om CYP2G1, CYP 7, CYP 8B1, CYP 11, CYP17 og CYP 19.  Både CYP 17 og CYP 19 (aromatasen) er specielt vigtige i denne sammenhæng for ved at hæmme dem, kan vitale hormonale ubalancer opstå. Også fedtsyremetabolismen styres af CYPer såsom: CYP2J2, CYP4, CYP5 og CYP8.  Nogle af ovenstående CYPer er i varierende omfang også fundet i forskellige fiskearters leverceller (se nedenstående eksempler). Eksempelvis har ålekvabben og skrubben CYP1A-medierede afgiftningsenzymer i leveren.

4. Metabolisme i fisk

Indtil for få år siden troede man, at fisk kun kunne metabolisere miljøfremmede stoffer ved hjælp af CYP 1A. Men den genetiske kortlægning, der foregår for tiden af forskellige fiskearters gener, har vist, at dette ikke er korrekt. Ved hjælp af moderne genteknikker er fisks cytochrome P450 gener blevet fundet og kortlagt. Antallet af forskellige CYPer i fisk er omtrent lige så mange som i mennesket og hos rotten. Dertil viser det sig, at der overordnet findes en del lighed imellem de menneskelige CYP i leverceller, og de der er udtrykt hos Zebrafisken, ørreder, medakka,  og den japanske fugu fiskeart. Tabel 2 giver en oversigt over de CYPer, der virker både i mennesket og hos fiskearter, samt deres funktion. Tabellen er udarbejdet ved at sammenligne de genetiske koder for mennesker og fiskearter. Herved er det fundet, at mennesker og fisk har følgende ens CYP typer: CYP1, CYP2, muligvis CYP 3, CYP7, CYP8, CYP11, CYP17, CYP19, CYP20, CYP24 og CYP 27. Det vil sige, at man ikke kan udelukke, at fisks metabolisme ligner menneskets.

Flere fiskearter, såsom Zebrafisken, har blandt andet en del undergruppe CYPer i  både CYP1A og CYP3A, der måske ligner vores. Derfor kan det ikke udelukkes, at visse fiskearter både kan metabolisere for eksempel steroidhormoner (ved hjælp af CYP1A) og lægemidler (ved hjælp af CYP3A). Dertil kommer, at lægemidler formentligt derudover både kan hæmme eller opregulere funktionen af andre vigtige CYPer i fisken, hvad der kan forårsage toksikodynamiske reaktioner (Hegelund et al. 2004, Hasselberg et al. 2004, 2005).

At også de CYPer, der regulerer steroidgenesen findes både hos fisk og mennesker, er en vigtig opdagelse, For det betyder formodentligt, at de lægemidler, der kan opregulere eller hæmme steroidhormon systemet hos mennesker, har samme effekt på fisk.

Der findes dog kun begrænset litteratur på området, der viser, at de pågældende CYPer i fiskeleverceller kan metaboliserer visse lægemiddelstoffer (Hasselberg et al. 2005). Derimod er der en del tilsvarende undersøgelser, der har kortlagt metabolismen i fisk for andre miljøfremmede stoffer, såsom PAHer , PCB, og metaller. (Jørgensen  et al. 2001).

En række CYPer hos fisk, såsom CYP2K, CYP2N, CYP2P og som ikke er fælles med mennesket, er endvidere blevet associeret til biotransformation af miljøfremmede stoffer (Stegeman JJ 2006.) Det kan ikke udelukkes, at de vil kunne metabolisere lægemiddelstoffer.

Tabel 2. Sammenligning af CYP ligheder i mennesker og fiskearter og deres funktion.

Cytochrom P450 system CYP i mennesket CYP i fisk Funktion
CYP1 CYP1A1      human CYP1A1      Oncorhynchus mykiss (trout) Metaboliserer lægemidler, miljøfremmede stoffer og steroider
  CYP1A2      human   Metabolisere miljøfremmede stoffer, og lægemidler
    CYP1A3      Oncorhynchus mykiss (trout)  
  CYP1B1      human CYP1B1      Platichthys flesus (European flounder)
CYP1B1      Danio rerio (zebrafish)
CYP1B1P     Danio rerio (zebrafish)
CYP1B1      Cyprinus carpio (common carp)
CYP1B1      Fugu rubripes (Takifugu rubripes) pufferfish
CYP1B1      Tetraodon nigroviridis (freshwater pufferfish)
Ukendt funktion
CYP 2 CYP2R1      human CYP2R1      Danio rerio (zebrafish)
CYP2R1      Fugu rubripes (pufferfish)
Metaboliserer lægemidler og steroider
CYP3 CYP3A4      human   Metabolisere lægemiddelstoffer og steroider
    CYP3A48     Fugu rubripes (pufferfish)
CYP3A49     Fugu rubripes (pufferfish)
CYP3A50P    Fugu rubripes (pufferfish)
CYP3A56     Fundulus heteroclitus (killifish)
? ligner måske CYP3A4 hos mennesker
    CYP3B1      Fugu rubripes (pufferfish)
CYP3B2      Fugu rubripes (pufferfish)
CYP3C1      Danio rerio (zebrafish)
CYP3D1      Fugu rubripes (pufferfish)
 
CYP17 CYP17       human CYP17       Oncorhynchus mykiss (rainbow trout)
CYP17       Oryzias latipes (medaka)
CYP17       Squalus acanthias (dogfish)
CYP17       Ictalurus punctatus (channel catfish)
CYP17A1     Fugu rubripes (pufferfish)
CYP17A1     Danio rerio (zebrafish)
CYP17A2     Fugu rubripes (pufferfish)
CYP17A2     Danio rerio (zebrafish)
Steroid biosynthesis.
Hvis CYP 17 hæmmes så
hæmmes androgen syntesen
CYP19 CYP19       human CYP19       Ictalurus punctatus (channel catfish)
CYP19       Onchorynchus mykiss (rainbow trout)
CYP19       Carassius auratus (goldfish)
CYP19       Oryzias latipes (medaka)
CYP19       Tilapia nilotica (Cichlid fish)
CYP19       Haplochromis burtoni (cichlid fish)
CYP19       Paralichthys olivaceus (Japanese Flounder)
CYP19A1     Fugu rubripes (pufferfish)
CYP19A1     Danio rerio (zebrafish) ovarian
CYP19A      Danio rerio (zebrafish) brain
CYP19A2     Fugu rubripes (pufferfish
Steroid biosynthesis.
Hvis CYP 19 hæmmes så
hæmmes aromatasen dvs. omdannelsen af androgen til østrogen
CYP20 CYP20       human CYP20       Fugu rubripes (pufferfish)
CYP20       Oryzias latipes (medaka fish)
CYP20       Tetraodon nigroviridis (freshwater pufferfish)
CYP20       Danio rerio (zebrafish)
CYP20       Salmo salar (Atlantic salmon)
Ukendt funktion
CYP24 CYP24       human CYP24       Fugu rubripes (pufferfish)
CYP24       Danio rerio (zebrafish)
Vitamin D nedbrydning.
Dannelse af vitamin D 24-hydroxylase
(Vitamin D)
CYP27 CYP27A1     human CYP27A1     Fugu rubripes (pufferfish) Galdesyre biosyntese
Vitamin D og steroidsyntesen
  CYP27B1     human CYP27B1     Fugu rubripes (pufferfish)
CYP27B1     Danio rerio (zebrafish)
(1-alpha hydroxylates vitamin D)
(Vitamin D)
CYP 11 CYP11A1     human CYP11A1     Oncorhynchus mykiss (rainbow trout)
CYP11A1     Fugu rubripes (pufferfish)
CYP11A1     Danio rerio (zebrafish)
Steoridbiosyntese
Enzym i cholesterol syntesen
(steroid metabolismen)
  CYP11B1     human CYP11B1     Danio rerio (zebrafish) Steroidbiosyntese
11 beta hydroxylase : omdanner  kortisol fra 11-deoxycortisol)

CYP8 CYP8A1      human CYP8A1      Fugu rubripes (pufferfish)
CYP8A1      Danio rerio (zebrafish)
Syntese af prostacyclin
  CYP8B1      human CYP8B1      Fugu rubripes (pufferfish)
CYP8B1      Danio rerio (zebrafish)
Galdesyre biosyntesen
CYP7 CYP7A1      human CYP7A1      Fugu rubripes (pufferfish) Galdesyre biosyntese 7-alpha hydroxylase af steroid syntese
(liver specifik) = cholesterol 7 alpha hydroxylase
first and rate-limiting step of bile acid synthesis ie. cholesterol degradation

5. Eksempler på hæmning eller induktion af CYP funktion

I litteraturen beskrives en del studier, der viser, hvordan lægemidler kan hæmme eller opregulere CYPer, således at de kan forårsage en toksikodynamisk reaktion på organsimen.  I tabel 3 er der vist nogle eksempler.  Samme type mekanismer må formodes at kunne virke ved hæmning eller induktion af CYP 17, 19, 20 24, og 27, da de overordnet set har samme funktioner i fisk og mennesker. Andre lægemiddel-lægemiddel eller lægemiddel- kemikale interaktioner må formodes også at kunne forløbe, da lægemiddelstoffer i miljøet ofte forekommer som blandinger.

Tabel 3. Eksempler på lægemidler, der kan opregulere eller hæmme andre CYPer og derved forårsage en toksikodynamisk interaktion.

Lægemiddelstof Stof der påvirker metabolismen Mekanisme Toksikodynamisk interaktion
Hæmning af CYP mekanisme
Metroprolol Paroxetine CYP2D6 Øget hjertefrekvens
Warfarin Fluconazole CYP2C9 Øget antikoagulation (fortykning af bloddet)
Omeprazole Ticoldipine CYP2C19 Nedsat ADP-induceret blodlegeme aggregation
Paracetamol Erythromycin CYP1A2 Hæmmer levertoksistenten
Induktion af CYP mekanisme
Propafenone Rifamycin CYP2D6, CYP1A2 Øget hjertearrytmi
Valproate Gingko Biloba CYP2C9, CYP2C19 Nedsat immunforsvar
Omeprazole Ginko Biloba CYP3A4 Øger virkningen
Paracetamol Broccoli CYP3A4 Øger levertoksisiteten

Thibaut og medarbejdere har tidligere vist, at de lipidregulerende fibrater (clofibrate, fenofibrate, bezafibrate, gemfibrozil), Ibuprofen, og de antidepressive stoffer (fluoxetine, paroxetine og fluvoxamine) alle påvirker CYP katalyserede mekanismer i karpeleverceller. De viste også, at antidepressive stoffer hæmmer fiskens CYP1A med 92-94%, at CYP3A-lignende CYP er blevet hæmmet 69-80% og at CYP2K, som kun udtrykkes hos fisk, er blevet hæmmet 36-69%. Ibuprofen hæmmede et andet CYP, der findes i fisk, CYP2M, med 32-74%. De lipidregulerende stoffer hæmmede også CYP2M aktiviteten med 91%.

Ibuprofen hæmmede endvidere også fase II metabolismen (der gør stofferne mere vandopløselige) af naphtol og testosterone, hvorved udskillelsen af disse stoffer bliver hæmmet (Thibaut et al. 2006). Ovenstående eksempler viser, at lægemiddelinteraktioner kan være en vigtig toksicitetmekanisme, når fisk eksponeres for blandinger af lægemidler.

6. Eksempler på lægemidlers farmakologiske eller toksikologisk mekanismer i fisk.

Der findes en del eksempler på, at lægemidler både til humant og til veterinært brug kan udvise effekter på såvel fisk som andre levende organismer i det akvatiske miljø (Crane et al. 2006, Floate et al. 2005, Fent et al. 2006).

Antidepressive lægemiddelstoffer, såsom de selektive serotonin ”re-uptake” hæmmere (SSRI), fluoxetine eller ciprofloxacine, har vist sig at være nogle af de mest potente lægemiddelstoffer til humant brug, når de optræder i det akvatiske miljø. Senest er fluoxetine, sertraline og metabolitterne norfluoxetine og desmethylsertraline alle blevet fundet i flere fiskearter (Leponis macrochirus, Ictalurus punctatus, Cyprinus carpio, og Pomoxis nigromaculatus) i det nordlige Texas, hvor fisken har opholdt sig ved udløbet af et renseanlæg og i et koncentrationsniveau på mere end 1 ng/g fisk (Brooks et al. 2005).  En del studier har undersøgt, hvorledes ændringer i plasma serotoninniveauet påvirker fisk i in-vitro studier, og at en ændring i serotoninkoncentrationen i fisk forårsager forskellige effekter på reproduktionen. I nogle fiskearter, såsom Fundulus heteroclinitus, vil serotonin hæmme den steroidinducerede modning af oocyter og derved hæmme reproduktionen (Cerda et al. 1998). Hos Medaka (Oryzias latipes), ved man, at serotonin modsat inducerer oocyte modningen og derfor hos denne art øger reproduktionen (Iwamatsu et al. 1993). Tidligere har Brooks og medarbejdere vist, at østradiol (E2) plasma koncentrationen hos Medaka (Oryzias latipes), blev øget mellem 10% og 100%, når fisken blev eksponeret for fluoxetine koncentrationer på henholdsvis 0,1 og 0,5 µg/l (Foran et al. 2004). Derimod forblev koncentrationen af plasma testosteron uforandret.

Diazepam, et ofte anvendt benzodiazepinderivat, er fundet at have en akut toksisitet på fisk ved koncentrationer under 100 mg/l (Fent et al. 2006).

Smertestillende lægemidler såsom salicylate, ibuprofen og paracetamol (acetaminophen) er blevet undersøgt for endocrine effekter hos ørreder (Gravel og Vijayan 2006). Det blev vist, at alle tre stoffer havde effekt på kortisondannelsen i fiskens nyrer, fundet ved et in-vitro assay med nyreceller. Der blev målt en hæmning på 20-40% af dannet adrenokortikotrophe hormon (ACTH), et hormon, der mediere kortisondannelsen. Yderligere viste det sig, at salicylate behandlede fisk også udviste et fald i genekspressionen af proteinet StAR, et protein der regulerer steroidgenesen, og af GR, et glukokorticolid receptor protein, der findes i fiskens hjerne. Forfatterne konkluderer derfor, at salicylate udviser en korticoidforstyrrende effekt  i ørreders nyresteroidgenese, samt at det hæmmer hjernens glucocordicoidsignaler.

Paracetamols effekt på vertebrater har tidligere været anvendt til at kontrollere populationen hos den brune snog (Boiga irregularis) i Guam. Vandige opløsninger af paracetamol på 40mg/l dræbte snoge, som ellers var i antalsmæssig fremgang. Den toksiske mekanisme skyldes dannelsen af metaboliten N-actyl-p-benzo-quinone imine ved CYP2E. Denne metabolit bliver normalt detoksificeret ved konjugation med gluthation eller sulfat, men hvis disse konjugeringsmekanismer mættes, så udøver metabolitten sin levertoksicitet. En del vertebrater kan ikke glucuronidere og for dem er paracetamol meget giftigt, da sulfat-detoxificationen hurtigt opbruges (Court og Greenblatt, 1997).

NSAID stoffer såsom ibuprofen og diclofenac kan hos mennesker kan virke nyretoksiske ved en ikke selektiv hæmning af cyclooxygenasen. En hæmning af cyclooxygenasen gør, at prostaglandinsyntesen bremses og indvirker så også på andre processer i nyrene, som at involvere prostagandiner.  Lignede kan formodentligt også ske hos fisk. De mere selektive COX inhibitorer har lignende nyretoksiske bivirkninger, da fisk har cyclooxygenase-2 enzymer (Gambaro og Pezarra, 2003).

Beta-blokkerne, propranolol og metroprolol har også vist sig at have effekt på fisk. Der er lavet en del studier, hvor man har søgt at vise disse stoffers blodtrykssænkende egenskaber hos fisk (Sumpter og co-workers in prep.)

De syntetiske hormoner, som også i Danmark er fundet i biologisk aktive koncentrationer i behandlet spildevand (Stuer-Lauridsen et al. 2005), er det bedst kendte eksempel på, at en stofgruppe, der både har farmakologisk og toksikologisk effekt specielt på fisk, findes i det akvatiske miljø. Om P-pille østrogenet, ethinyløstradiol (EE2) og 17 ß-østradiol ved man at de er specielt potente (PNEC = 1- 5 ng/l) på fisk (Young et al. 2002). Nash et al. (2004) har vist at hvis en zebrafiskepopulation bliver eksponeret for sådanne koncetrationsniveauer, så vil populationens formeringsevne nedsættes 56%.  Allerede en koncentration på 0,1 ng/l har vist sig at udløse en overproduktion af vitallogenin hos hanørreder (Purdum et al. 1994). Endeligt er det vist, at EE2 i en koncentration på 0,03 mg/l gav anledning til dannelse af tvekønnethed hos den japanske risfisk (Oryzias latipes) (Metcalfe et al. 2001). Det er vigtigt at understrege, at ovenstående eksempler alle er observeret ved koncentrationsniveauer, der enten er  miljørelevante eller på niveauer, som kun er let forhøjede i forhold til de niveauer, man kan observere i Danmark (Stuer – Lauridsen et al. 2005).

7. Mutagene, genotoksiske eller teratogene effekter i fisk

En del kemikalier og lægemiddelstoffer er kendt for at have mutagene egenskaber. Herved kan kemikaliet og lægemiddelstoffet introducere arvelige genetiske ændringer (mutationer), det være sig tab af gener eller dele af chromosomer i cellens genotype. Som yderste konsekvens vil det kunne påføre næste generation af arten sygdomme eller deformiteter. Hvis effekten er en ødelæggelse af et genetisk materiale eller en ændring af genomet for eksempel en mutation, kromosomfejl, siges stoffet at være genotoksisk.

Kemikalier og lægemidler der, når de gives til gravide, inducerer en permanent strukturel deformitet eller sygdom på afkommet kaldes teratogene.

Der er eksempler på, at lægemiddelstoffer er genotoksiske eller teratogene. Generelt medfører en lang række cytostatika, antibiotika og antivirale midler både genotoksiske egenskaber og teratogene effekter på mennesket (lægemiddelkataloget 2003). Både mutagene og teratogene effekter af industrikemikalier kendes på fiskearter. Derfor er det er muligt, at også lægemiddelstoffer, der har en genotoksisk eller teratogen effekt på mennesket, kan have lignende effekt på fisk (Ritter et al. 1985). Der er endnu ikke i litteraturen beskrevet sådanne effekter af lægemiddelstoffer hos fisk.

8. Ålekvabben – dens metabolisme og toksicitet forårsaget af lægemiddelstoffer

Som omtalt i bilag 2 undergår ålekvabben en kønnet tilblivelse, der gør den afhængig af to processer: kønsbestemmelsen, som bestemmer det genotypiske køn, og kønsdifferentieringen, som bestemmer det fænotypiske køn. Gonadernes differentiering fører efterfølgende til dannelsen testikler eller ovarier (Nakamura et al., 1998; Devlin og Nagahama, 2002) (ref i Pouls tekst!). Kønsbestemmelsen anses generelt for at være under genetisk kontrol, og den finder sted allerede når æggene befrugtes. Processen styres hovedsageligt af endogene kønshormoner (de hunlige østrogener og de hanlige androgener). Det naturlige østrogen inducerer en differentiering i ynglens ovarie, mens androgen inducerer testiklers differentiering. Derfor må man formode, at lægemiddelstoffer som steoridøstrogenerne: ethinyløstradiol (EE2), 17-betaøstradiol, østrone eller østriol, som alle har østrogen effekt på fiskearter, også kan påvirke ålekvabbens kønsdifferentiering og reproduktion. Da ålekvabbens steoridgenese er veludviklet, er det forventeligt, at lægemiddelstoffer såsom tamoxifen eller fluvestran, (der har en anti-østrogen effekt) eller flutamid (der har en antiandrogen effekt) og som anvendes i cancerbehandling, alle har en hormonlignede effekt på ålekvabben, hvis stoffet er til stede i høje koncentrationer. Alle tre stoffer anvendes dog i meget små mængder i de undersøgte recipienter.  I Århus Amt er det samlede forbrug af disse stoffer opgjort til under 5 kg pr. år hvorfor recipient koncentrationerne må være meget lave.

Ålekvabbens genetik er endnu ikke så velbeskrevet som eksempelvis zebrafiskens. Alekvabbens CYP metabolisme ses endnu ikke publiceret. Da ålekvabben er genetisk beslægtet med andre fiskearter, må man formode, at de overvejelser, der er gjort om genetisk samhørighed med mennesket og de anførte fiskarter, også gælder for denne art.

I det følgende er resultaterne, kortlagt i appendiks A, for de 20 mest solgte lægemiddelstoffer efter vægt (kg) omtalt. I appendiks A er der for hvert lægemiddelstof samlet informationer om stoffernes farmakologiske effekt, farmakodynamik (virkningsmekanisme) hos mennesker, og om de er mistænkt for en teratogen eller genotoksisk effekt. Dernæst er vist hvilke CYPer, der er ansvarlige for metabolisme af stoffet i mennesket. Til sidst gives, om muligt, en vurdering af CYP forekomst, metabolisme samt farmakologisk effekt på fisk opnået med  ”read across” oplysninger og teknikker.

Acetylsalicylsyre:  virker  ved at hæmme dannelsen af protaglandiner og tromboxaner. Derudover virker stoffet ved at hæmme cyclooxygenasen både perifert og centralt i organismen. Der er ikke fundet oplysninger om, at stoffet udviser teratogene eller genotoxiske effekter på hverken menneske eller fisk. Acetylsalicylsyre metaboliseres i mennesket ved CYP 3A4 og 2C9. En form for cyclooxygenase er beskrevet i ørreden (Dombovsky et al. 2004), hvor hverken CYP3A eller CYP2C9 findes. Flere forfattere beskriver dog CYP3A-lignende CYPer i fiskearter, hvorfor det ikke kan udelukkes, at acetylsalicylsyre kan metaboliseres i fisk. Et studie har endvidere vist, at salicylate, et nedbrydningsprodukt af acetylsalicylsyre, har en korticoid-forstyrrende effekt i ørredens nyreceller (Graval og Vijaya 2006). Stoffet er ikke et potent akuttoksisk stof på fisk.

Paracetamol har effekt på menneskers varmereguleringscenter i hjernen. Der er intet der tyder på, at stoffet har samme farmakologiske effekt på fisk. Paracetamol metaboliseres i mennesker ved CYP1A2, 2E1 og 3A4. Der er ikke fundet oplysninger om, at stoffet udviser teratogene eller genotoxiske effekter hverken på menneske eller fisk. Både former af CYP1A og CYP3A er beskrevet hos fisk, hvorfor det ikke kan udelukkes at stoffet blive metaboliseret i fisk. Derfor kan det heller ikke udelukkes at den ”giftige metabolit” N-actyl-p-benzo-quinone imine bliver dannet i fisk. Denne metabolit er nyretoksisk i både mennesker og dyr, hvis den ikke detoksificeres ved phase II metabolisme. Paracetamol er ikke potent akuttoksisk stof i fiskearter.

Ibuprofen er et NSAID præparat der hæmmer prostaglandinsyntesen. Ibuprofen metaboliseres ved CYP 2C9. En teratogen effekt er kendt i mennesker (lægemiddelkataloget, 2003). En form for cyclooxygenase enzym er beskrevet i ørreden (Dombovsky et al. 2004), men CYP2C9 findes ikke i fisk. Der kan ikke udelukkes, at stoffet har en farmakologisk effekt på fisk, men vil næppe metaboliseres på samme måde som hos mennesket. Ibuprofen har effekt på kortisondannelsen hos ørreden. Thibaut el at. 2006 viste endvidere, at Ibuprofen hæmmer CYP2M og fase II metabolismen i karpeleverceller. Ibuprofen er et ikke særlig potent akut toksisk stof i fiskearter.

Metformin stimulerer intracellular glycogensyntese ved at øge transportkapaciteten af alle typer af membranglukosetransportører. Disse transportører findes også i fisk, hvorfor metformin kan have en farmakologisk effekt på fisk, selvom den ikke er beskrevet i litteraturen (Capilla et al 2004). Da CYP 2C8 ikke findes i fisk, vil en eventuel metabolismen foregå via andre mekanismer. Metformin udviser ikke akut toksicitet i fiskearter.

Phenoxymethylpenicillin er et antibiotikum. Det har ingen farmakologisk effekt på fisk. Der er ikke rapporteret genotoksiske eller teratogene effekter på mennesker. Stoffet udviser ikke akuttoksicitet i fiskearter.

Etodolac er en selektiv hæmmer af cyclooxygenase-2, der danner prostaglandiner. Metabolismen er ikke kendt i mennesket. Der er ikke rapporteret genotoksiske eller teratogene effekter på mennesker. En farmakologisk effekt på fisk er muligt, da cyclooxygenase-2 er udbredt for eksempel hos laksen. (Fast et al. 2006).

Cimetidin er en selektiv histamine H2 receptorantagonist. Cimetidine metaboliseres via CYP3A i mennesket og hverken teratogen eller genotoksisk effekter på mennesker og fisk er rapporteret. Visse former for histaminreceptorer er derimod rapporteret hos fisk, hvorfor stoffet formentligt har en farmakologisk effekt på fisk. En form af CYP3A er beskrevet hos fisk, hvorfor man ikke kan udelukke at cimetidin bliver metaboliseret. Stoffet er ikke potent akuttoksisk på fisk.

Metoprolol er en ß1 selektiv receptorblokker og anvendes i forbindelse med forhøjet blodtryk. Stoffet er kendt for at have en teratogen virkning på nyrer og kranieforbeningen hos mennesker. Metoprolol metaboliseres ved CYP 2D6 hos mennesker, en CYP der ikke er beskrevet hos fisk. Forfatteren har kendskab til upublicerede canadiske studier om metoprolols effekt på fisk  (Metcalf et al. Personlig kommunikation), da fisk har både ß1 og ß2 receptorer i hjertet. Hvis stoffet metaboliseres hos fisk, sker det ved andre mekanismer end hos mennesker.

Valproinsyres effekt tilskrives en forøgelse af GABA neurotransmitteren. Stoffet udviser en teratogen effekt som udmøntes i en neuralrørsdefekt. Metabolismen hos mennesker sker over CYP19. Flere videnskabelige artikler beskriver, at fisk har GABA receptoren, så stoffet potentielt har en farmakologisk effekt (Stehr et al. 2006). Valproinsyre hæmmer desuden CYP 19 (aromatasen) i in-vitro asaay, en CYP der er påvist i fisk. Stoffet kan derfor potentielt give en ubalance i androgen/østrogen niveauet. Metabolismen i fisk kan ikke forudsiges, da CYP2C19 ikke er udtrykt i fisk.

Dicloxacillin er et antibiotikum og har derved ingen farmakologisk effekt på fisk. Der er ikke rapporteret genotoksiske eller teratogene effekter på mennesker.

Tramadol er et smertestillende middel, der virker via morfin receptorer. Desuden sker der en frigivelse af serotonin. Hos visse fiskearter vil en frigivelse af serotonin forstærke modningen af oocyter, der igen potentielt kan påvirke reproduktionen (Foran et al. 2004). Om denne mekanisme er tilstede i ålekvabben vides ikke. Metabolismen i mennesket foregår via CYP 3A4 og 2A6, hvorfor fisk potentielt kan metabolisere via CYP3A undergrupper.

Gabapentin tilskrives en forøgelse af GABA neurotransmtteren. Stoffet udviser en teratogen effekt, som udmøntes i en neuralrørsdefekt. Metabolismen hos mennesker sker over CYP19. Flere videnskabelige artikler beskriver, at fisk har GABA receptoren, hvorved stoffet potentielt har en farmakologisk effekt (Stehr et al. 2006).

Furosemid er et vanddrivende middel, som hæmmer reabsorptionen af Na+/2Cl-/K+. Metabolismen foregår ved CYP3A4, hvorfor stoffet potentielt kan metaboliseres i fisk. Na/K pumpen er udbredt i fiskearter. Derfor kan en farmakologisk effekt ikke kan udelukkes.

Oxcarbazepin – mekanismen er ikke velbeskrevet. Tetratogent kan stoffet inducere neuralrørs-defekt i mennesket. Metabolismen foregår via CYP 3A4 i mennesket. Nogle fiskearter kan muligvis metabolisere stoffet via CYP3.

Dipyridamol hæmmer adenosinoptagelsen i erytrocytter og trompocytter. Umiddelbart kan det ikke fastslås, om stoffet kan have effekt på fisk. Derimod kan det ikke udelukkes, at fisk kan metabolisere stoffet, der i mennesker foregår via CYP3A

Sulfamethizol er et antibiotikum og har derved ingen farmakologisk effekt på fisk. Stoffet er rapporteret teratogent i dyr. Fisk kan ikke umiddelbart metabolisere stoffet.

Carbamazepin mekanismen er ikke velbeskrevet. Stoffet har en tetratogen effekt der viser sig som en neuralrørsdefekt i mennesket. Metabolismen foregår via CYP 3A4 i mennesker. Nogle fiskearter kan muligvis metabolisere stoffet via CYP3.

Allopurinol anvendes mod urinsur gigt og virker ved at stimulere insulinfrigivelsen fra beta-celler i bugspytkirtlen. Umiddelbart kan det ikke vurderes, om stoffet har en farmakologisk effekt på fisk. Metabolismen er ikke kendt.

Amoxicillin er et antibiotikum og har derved ingen farmakologisk effekt på fisk. Stoffet giver teratogen effekt i form af nefrotoksicitet og ototoksicitet. Fisk kan ikke umiddelbart metabolisere stoffet.

Simvastatin et et lipidsænkede middel, der bl.a katalyserer et tidligt og hastighedsbegrænsende trin i kolesterol systensen. Metabolismen foregår i mennesker via CYP 3A4.

CYP 11, som styrer bl.a. dele af kolesterol syntesen er både udtrykt hos mennesker og fisk. Derfor vil man kunne forvente, at stoffet har effekt på fisk. Stoffet er også, som det eneste i top 20 listen (tabel 1) fundet akuttoksisk i fisk. Nogle fiskearter kan muligvis metabolisere stoffet via CYP3.

Lægemiddelstoffer, som generelt hæmmer enten CYP 17 eller CYP 19, kan potentielt have effekt på fisk. En række antiepileptiske lægemidler såsom valproinsyre,  carbamazepin, oxcarbazepin og ethosuximid  (de tre første anvendes i stor målestok i Danmark) er i et in vitro-assay påvist, at hæmme CYP19 (aromatasen) (Jacobsen et al. submitted). Da steroidgenesen foregår i ålekvabben, vil stoffer højst sandsynligt skabe en ubalance i testosteron/ østrogen balancen. Dette kan forårsage er række forplantningsproblemer i fisken.

Fong (2001) forfattede et review over selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) effekt på både vertebrater og invertebrater og undersøgte stoffernes evne til at modulere serotonins tilgængelighed for forskellige arter. Det viser sig, at der hos fisk er en relation imellem Oocyterns modning og serotoninkoncentrationen i cellen. Mekanismen er dog forskellig i forskellige fiskearter (Iwamatsu et al. 1993; Cerda et al. 1998; Fong 2001). I medakka modnes oocyter ved eksponering af serontonin, hvorimod en lang række andre fiskearter ikke påvirkes i deres reproduktion af en serotonin eksponering. Derfor bør SSRI stoffernes mekanisme på ålekvabber undersøges nærmere, hvis man ønsker at anvende denne art som indikatorfisk, da SSRI stofferne ofte måles i vandmiljøet.

Behandlet spildevand indeholder ofte blandinger af 10 eller 20 lægemiddelrester (Halling-Sørensen et al. 1998). Da lægemiddelstoffer, som ovenfor beskrevet, kan hæmme den CYP relaterede metabolisme fra andre lægemiddelstoffer eller miljøfremmede kemikalier, kan en induktion eller hæmning af CYPer måske være den vigtigste toksikodynamiske egenskab, som lægemidlerne tilfører vandmiljøet.

En række lægemiddelstoffer forårsager teratogene og gentoksiske effekter på mennesker. Specielt ved man, at en række anti-cancermidler, antibiotika  og antivirale lægemidler har sådanne egenskaber. Specielt på hospitaler kan koncentrationen af anti-cancermidler være betydelig. Recipienter, der modtager renset spildevand og hvor hospitaler har tilledt spildevand til renseanlægget, kan ikke udelukkes at modtage lægemidler, der har en teratogen eller genotoksisk effekt på recipienten pga. et potentielt indhold af antibiotika eller anticancermiddel.

APPENDIX A

De 20 mest anvendte lægemiddelstoffer til humant brug, deres farmakologiske effekt, mode og action, teratogen og toxikogentisk effekt, CYP metabolisme samt potentielle farmakologiske effekt hos fisk.

Klik her for at se tabellen.

Referencer:

Neill JD, Musgrove LC, Duck LW (2004) Newly recognized GnRH receptors: function and relative role. TRENDS IN ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM 15 (8): 383-392 OCT 2004

ECOSAR Database (2005). Retrieved May 2005 from http://www.uoguelph.ca/%7Ehsander/ALL%20MATCHES1.xls (from Sanderson, H., Johnson, D.J., Reitsma, T., Brain, R.A., Wilson, C.J., Solomon, K.R. (2004) Ranking and prioritization of environmental risks of pharmaceuticals in surface waters. Regulat. Toxicol. Pharmacol. 39(2):158-183

Ferrari, B., R. Mons, B. Vollat, B. Fraysse, N. Paxeus, R. Lo Giudice, A. Pollio and J. Barric. (2004) Environmental risk assessment of six human pharmaceuticals: are the current environmental risk assessment procedures sufficient for the protection of the aquatic environment? Environmental Toxicology and Chemistry 23(5):1344-1354

Halling-Sørensen, B., S. Nors Nielsen, P. F. Lanzky, F. Ingerslev, H. C. Holten Lützhøft and S. E. Jørgensen. (1998) Occurrence, fate and effects of pharmaceutical substances in the environment - a review. Chemosphere 36(2):357-393.

U.S. Environmental Protection Agency. 2005. ECOTOX User Guide: ECOTOXicology Database System. Version 3.0. Available: http:/www.epa.gov/ecotox/

Webb, S.F. (2001) A data-based perspective on the environment risk assessment of human pharmaceuticals I - collation of available ecotoxicity data. Phamaceuticals in the Environment: Sources, fate effects and risks. K. Kummer. Springer_Verlag, Berlin.

Hegelund T. , Ottosson K., Tomberg P, RådingerM og Celander MC, 2004 Effects of ketoconazole on CYP1A and CYP3A in rainbow trout and killfish. Enviorn. Toxicol and Chem 23, 1326-1334

Hasselberg L, Meier S, Hegelund, T, Svardal A and Celander MC (2004) Effects of alkylphenols and 17 beta-estradiol og CYP 1A and CYP3A in adult Atlatic cod (Gadus morhua) Aquat. Toxicol 67, 303-13

Hasselberg L, Grøsvik B-E, Goksøyr A and Celander MS 2005. Interaction between xenoestrogens and ketoconazole on CYP1A og CYP3A in juvenile Atlantic cod (Gadus morhua). Comp Hepatol. 4:2

Jørgensen EH, Celander M, Goksøyr A and Iwata M (2001) The effect of stress on toxicant-dependent cytochrome P450 enzyme responses in the Arctic charr (Salvenius alpinus) Environ Toxicol. Chem. 20 2523-29.

Stegeman JJ 2006 Cytochrome P450 in development toxicity. Boston medical campus project  grant 5P42ES007381-090012.

Thibaut R, Schnell S, Porte C, (2006) The interference of pharmaceuticals with endogenous and xenobiotic metabolizing enzymes in carp liver; An in-vitro study. Environmental Science and Technology 40: 5154-60

Crane M, Watts C, and Boucard T. 2006, Sci. Total Environment in press

Floate KD, Wardhouge KG, Boxall AB and Sharratt TN. 2005, Annu. Rev. Entomol 50:153-179

Fent K, Weston AA, and Caminada D (2006). Aquat Toxicol 76: 122-159

Ritter EJ, Scott JR, Randall JL, Ritter JM (1985) Teratogenicity of Dimethoxyethyl Phthalate and
Its Metabolites Methoxyethanol and Methoxyacetic Acid in the Rat ... TERATOLOGY 32:25-31

Dombkowski RA, Russell,MJ Olson K (2004) Hydrogen sulfide as an endogenous regulator of vascular smooth muscle tone in troutAm J Physiol Regul Integr Comp Physiol 286: R678–R685, 2004;

Capilla, E.  Di´az, M. Albalat,A  Navarro, I , Pessin, JE , Keller,K and Planas, JV (2004) Functional characterization of an insulin-responsive glucose transporter (GLUT4) from fish adipose tissue Am J Physiol Endocrinol Metab 287: E348–E357,

Fast MD,  Muise DM, Easy RE, Ross NW, SC Johnson (2006) The effects of Lepeophtheirus salmonis infections on the stress response and immunological status of Atlantic salmon (Salmo salar). Fish & Shellfish Immunology 21 (2006) 228-241

Stehr CM, Linbo TL, Incardona JP, Scholz NL (2006)The developmental neurotoxicity of fipronil: Notochord degeneration and locomotor defects in zebrafish embryos and larvae TOXICOLOGICAL SCIENCES 92 (1): 270-278 JUL 2006

Foran CM, Weston J, Slattery M, Brooks B, Huggan DB (2004) Reproduktive assessment of Japanese Medaka (Oryzias latipes) following a four week fluoxetine (SSRI) exposure. Arch. Environ Contam Toxicol Vol 46:511-517.

Young WF, Whitehouse P, Johnson I, and Sorokin N (2002) Proposed Predicted-No-Effect-Concentrations (PNECs) for Neutral and Synthetic Steroid Oestragens in Surface Waters. R&D Technical Report P2-T04/TR1. WRc. Environmental Agency UK

Iwamatsu T, Toya Y, Sakai N, Yastuka T, Nagata R, Nagahama Y (1993). Effects of 5-hydroxytryptamine on steroidgenesis and oocyte maturation in pre-ovulatory follicles of the medaka Oryyias latipes Dev. Growth Diff 35:625-630.

Cerda J, Subhoder N, Reich G, Wallance RA, Selman K 1998, Oocyte sensitivity to serotonerigic regulation during the follicular cycle of the teleost Fundulus heteroclitus. Biol Reprod. 59:53-61.

Court og Greenblatt, 1997 Biochem Pharmacol. 53:1041-47

Gambaro og Pezarra, 2003 J Intern Med. 253:643-652

Nash JP, Kime DE, Van d, Wester PW, Brion F, Maack G, Stahlschmidt-Allner P and Tyler CR (2004) Environ Helath Perspective 1121725-1733

Purdum C, Hardiman P, Bye V, Eno N, Tyler C, and Sumpter J (1994) Estrogenic effects of effluent from sewage treatments works. Chemistry and Ecology 8:275-285

Stuer-Lauridsen F, Kjølholt J, Høibye L, Hinge-Christensen S, Ingerslev F, Hansen M, Krogh K, Andersen HR, Halling-Sørensen B. Hansen N, Køppen B, Bjerregaard P, and Frost B. (2005) Survey of estrogenic acitivity in the Danish Aquatic Environment. Environmental Project No 977.  Danish Environmental Protection Agency.

Metcalfe CD, Metcalfe TL, Kiparissis Y, Koenig BG, Khan C, Hughes RJ, Croley TR, March RE, Potter T (2001) Estrogenic potency of chemicals detected in sewage treatment plant effluents as determined by in vivo assays with Japanese medaka (Oryzias lapitas) Environ Toxicol Chem 20:297-308

Lægemiddelkataloget, 2006 www.lka.dk

Fong PP (2001) Antidepressant in aquatic organisms: A wide range of effects. In: Daugton GG and Jones-Lepp TL (eds) Pharmaceuticals and personal care products in the environment. Scientific and regulatory  issues. American Chemical Society. Washington DC pp264-281.